Multiplex PCR

Zielgruppe

Technische und wissenschaftliche Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter mit und ohne Vorkenntnisse in der PCR-Technologie

Inhalte/Lernziele

Multiplex-PCR, die gleichzeitige PCR mit mehreren Primerpärchen in einer Reaktion, ist heute eine Standardmethode der PCR geworden. Waren es früher Gründe der Kosten und Zeitersparnis, so wird Multiplex-PCR heute benutzt, um Kontrollexperimente in einem Ansatz unter identischen Bedingungen durchzuführen. Derartige Anwendungen sind bei der Analyse von Expressionsmustern von Genen (RT qPCR) genauso wichtig wie bei dem Nachweis und der Quantifizierung von DNA in Untersuchungsproben. Dabei besteht die Aufgabe in der Multiplex-PCR nicht bloß darin, die Primermischungen zu optimieren, sondern bereits im Vorfeld spielt das Primerdesign eine bedeutende Rolle. Der Kurs ist für Anfänger der PCR ebenso geeignet wie für Fortgeschrittene. Nach einer Wiederholung der allgemeinen PCR-Grundlagen und der Template-Präparation beschäftigen wir uns mit dem Primerdesign für eine optimale Multiplex-PCR und gehen dann an die praktische Arbeit, einen DNA-Fingerprint mit 9 bis 13 einzelnen PCR als ein Multiplex aufzubauen. Wir besprechen die allgemeinen Regeln für das Temperatur-Zeit-Profil einer Multiplex-PCR ebenso wie die Besonderheiten in den Konzentrationen der einzelnen Reaktionskomponenten, die für eine erfolgreiche Multiplex-PCR notwendig sind. Zum Abschluss etablieren wir eine Multiplex-PCR mit interner Kontrolle, Referenzgen und Gene-of-Interest, wie es in heute üblichen Quantifizierungsexperimenten nötig ist.

Themenschwerpunkte

Primerdesign für die Multiplex-PCR, Optimierung des Temperatur-Zeit-Profiles für die PCR, Optimierung der Reaktionskomponenten, Anwendungsbeispiele: Deletionsscreening, DNA-Fingerprint, Quantifizierung mit interner Kontrolle, Referenzgen und Gene-of-Interest.