Northern Blot Labor-Kompaktkurs

Zielgruppe

Technische und wissenschaftliche Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter mit soliden Grundkenntnissen in der Molekularbiologie

Inhalte/Lernziele

Einzelne RNA-Sequenzen aus einem komplexen RNA-Gemisch können mittels spezifisch markierter RNA- oder DNA-Sonden nachgewiesen werden. Die Trennung der RNA erfolgt dabei unter denaturierenden Bedingungen mittels Agarose-Formaldehyd Gelelektrophorese. Um die nachzuweisende einzelsträngige RNA einer RNA- oder DNA-Sonde zugänglich zu machen, muss die elektrophoretisch aufgetrennte RNA auf eine spezielle Nylon- oder Nitrozellulosemembran transferiert werden. Dies geschieht mit Hilfe eines aufwärts gerichteten Kapillarflusses. Der so entstandene RNA-Abdruck auf der Membran entspricht genau dem ursprünglichen RNA-Bandenmuster im Gel. Danach erfolgt die Bindung spezifischer Sonden (Northern-Hybridisierung). Komplementär an der RNA gebundene Sonden werden anschließend durch Aktivierung einer Chemilumineszenzreaktion nachweisbar. Am Ende des Kurses sollen die Teilnehmer Anwendungsgebiete und Möglichkeiten der Methode kennen. Außerdem sollen sie in der Lage sein, Northern Blot Hybridisierungen selbstständig auszuführen. Dabei werden sie auch lernen, Ergebnisse zu beurteilen, sowie Probleme und Schwierigkeiten zu erkennen und zu lösen.

Themenschwerpunkte

Strategien zur Planung von geeigneten Sonden, Sondensynthese und Vorbereitung, Agarose-Formaldehyd Gelelektrophorese, Northern und Slot Blot, Sondenhybridisierung, Detektion mittels Chemilumineszenz-Reaktion, Stripping der Sonden, Trouble Shooting