Transfektion und Reportergenanalyse

Zielgruppe

Technische und wissenschaftliche Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter mit Vorkenntnissen in der Zellkultur

Inhalte/Lernziele

Dieser Kurs vermittelt zum einen die theoretischen und praktischen Grundlagen der transienten Transfektion primärer, humaner Zellen. Zum anderen geben wir Ihnen einen Überblick über die Anwendung verschiedener Reportergenanalysen zur Bestimmung der Transfektionseffizienz und Promotor-Aktivität. Im ersten Teil werden Probleme und Erfolgsfaktoren der Transfektion primärer Zellen besprochen. Dabei wird intensiv auf die Optimierung der Transfektionsparameter und das Trouble Shooting eingegangen. Außerdem stellen wir Ihnen unterschiedliche Transfektionstechnologien im Vergleich vor. Im zweiten Teil geht es anhand konkreter Beispiele um das experimentelle Design und den Einsatz verschiedener Reporterassays (Luciferase, GFP und beta-Galaktosidase) sowie deren quantitative Auswertung. Parallel zur Theorie führen Sie selbständig Transfektionen primärer humaner Zellen (Endothelzellen) mit unterschiedlichen Reportervektoren durch, bestimmen die Transfektionsraten anhand der Reporteraktivität mit Hilfe entsprechender Messverfahren (Luciferase-Assays, beta- Galaktosidase-Assays, Betrachtung GFP-transfizierter Zellen am Fluoreszenzmikroskop) und vergleichen die Ergebnisse mit parallel durchgeführten Transfektionen von permanenten Zelllinien.

Themenschwerpunkte

Planung, Durchführung und praktische Tipps zur transienten Transfektion primärer, humaner Zellen und Reportergen-Experimenten; Umgang mit Luminometer und Fluoreszenzmikroskop