Hinweise
 
 

Quiz-Auswertung

Zellviabilitäts–, Zellproliferations- und Zytotoxizitäts-Assays

 

Mit welchem der folgenden Assays kann man die Zellviabilität nicht bestimmen?

A)  WST-8 Assay

Der WST-8-Assay ist ein kolorimetrischer Zellviabilitätsassay. Das Tetrazoliumsalz WST-8 wird von viablen Zellen durch intrazelluläre Enzyme im Zellkulturüberstand zu wasserlöslichem, orange-farbenem Formazan reduziert. Die Absorptionsänderung der Lösung, die proportional zur Anzahl lebender, stoffwechselaktiver Zellen ist, kann spektrophotometrisch bestimmt werden.

B) Calcein-AM Assay

Calcein-AM ist ein Zellmembran-permeabler, nicht-fluoreszierender Farbstoff, der durch intrazelluläre Esterasen in das grün-fluoreszierende Zellmembran-impermeable Calcein hydrolysiert wird, das sich in der Zelle anreichert. Da Esterasen nur in lebenden Zellen aktiv sind, ist die Fluoreszenzintensität proportional zur Anzahl lebender Zellen in einer Population.

Richtige Antwort: C) β-Sekretase Fluorometric Assay

β-Sekretase (BACE) ist eine Membran-gebundene Aspartylprotease, die das Amyloid- Vorläuferprotein spaltet und bei der Entstehung der Alzheimerkrankheit eine wichtige Rolle spielt. Die Forschung an Inhibitoren der ß-Sekretase ist eines der Ziele bei der Entwicklung von Medikamenten gegen Alzheimer.

 

Auf welchem Prinzip basiert der Laktat-Dehydrogenase Assay?

Richtige Antwort: C)

Laktatdehydrogenase (LDH) ist ein Enzym, das im Zytoplasma der Zellen gebildet wird. Es wird ins Medium abgegeben, wenn die Zellmembran beim Zelltod durchlässig wird. Das LDH Cytotoxicity Kit II von PromoKine nutzt zusätzlich das WST-1-Reagenz, um die in den Zellkulturüberstand freigesetzte Laktatdehydrogenase sensitiv zu detektieren. Dabei wird das WST-1-Reagenz durch eine von der Laktatdehydrogenase katalysierte, gekoppelte Enzymreaktion in einen wasserlöslichen gelb-orangen Farbstoff umgesetzt. Die Farbintensität ist proportional zu der Zahl der toten Zellen.

 

Was sagen ATP- und ADP-Level über die Vitalität der Zelle aus?

Richtige Antwort: A)

Adenosintriphosphat (ATP) ist der universelle und unmittelbar verfügbare Energieträger und ein wichtiger Regulator energieliefernder Prozesse in jeder Zelle. Das ATP-Molekül besteht aus einem Adeninrest, dem Zucker Ribose und drei Phosphaten. Wird die Bindung zwischen den letzten beiden Phosphaten durch Enzyme hydrolytisch gespalten, entsteht das Adenosindiphosphat (ADP) und Orthophosphat. Bei der Spaltung der Bindung werden unter Standardbedingungen jeweils 32,3 kJ/mol Energie für Arbeitsleistungen in den Zellen frei. Vitale proliferierende Zellen regenerieren ADP schnell wieder zu ATP. Änderungen des ADP/ATP-Verhältnisses in Zellen können herangezogen werden, um zwischen viablen, metabolisch aktiven Zellen und zellulärem Arrest bzw. Zelltod zu unterscheiden. Vitale, proliferierende Zellen zeigen ein erhöhtes ATP- und ein vermindertes ADP-Level, während in nekrotischen Zellen der ATP-Gehalt fast nicht mehr nachweisbar ist. Während der Apoptose sinkt das ATP-Level, denn durch den Zusammenbruch des Protonengradienten über die Mitochondrienmembran wird die Atmungskette entkoppelt und damit auch die ATP-Bildung gestoppt. Das Verhältnis zwischen ATP und ADP verschiebt sich in apoptotischen Zellen zugunsten des ADP.
Unter Verwendung des Enzyms Luziferase, das ATP benötigt, um ein Substrat unter Abgabe von Lichtenergie umzusetzen, kann man die Level von ATP und ADP schnell und einfach detektieren und so die zytotoxische Wirkung einer Substanz genauer bestimmen.