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PCR Optimierung - NEU!

Inhalte & Lernziele

PCR, Real Time PCR und Multiplex-PCR laufen nicht immer zufriedenstellend, sei es dass die Nachweisgrenze zu gering ist, Inhibitoren auftreten, Primer nicht miteinander funktionieren oder einfach Kosten- und Zeitaufwand optimiert werden sollten.
Im Grunde besteht eine PCR-Analyse aus drei Verfahren mit eigenen Qualitätskontrollen: Template-Präparation, das eigentliche PCR und die anschließende PCR-Analytik.
Zum Thema Template-Präparation geben wir einen Überblick über die Vor- und Nachteile verschiedener Verfahren von single cell-Präparationen, quick and dirty, über schwierige Proben, reverse Transcription (cDNA-Synthese) bis zu genomischen DNA-Amplifikations-Kits. Zur PCR-Optimierung werden verschiedene Temperatur-Zeit-Profile und Reagenzien behandelt. In der PCR-Analytik geht es um die Kosten- und Zeitoptimierung, d.h. mit welchem Verfahren bekomme ich am schnellsten und kostengünstigsten ein zuverlässiges Ergebnis.

Im theoretischen Teil werden u.a. folgende Themen behandelt:

  • Prinzip der PCR und Real Time PCR
  • Komplexität unterschiedlicher Templates: Arabidopsis bis Zika-Virus
  • Methoden der Template-Präparation im Überblick
  • Ausgewählte Methoden: single cell DNA-Präparation, Nahrungsmittel, cDNA-Synthesen, genomische Amplifikation 
  • PCR: Temperatur-Zeit-Profile, Annealing-Temperatur, Magnesium und Primer-Titration
  • Multiplex-PCR: Puffer und Additive, Primer- und Sonden-Kontrolle, OD-Messung, in-silico PCR, BLAST, Oligoanalyzer
  • PCR-Analytik: wir diskutieren und vergleichen verschiedene Verfahren zum Nachweis von DNA-Fragmenten, zur Genotypisierung und zur Sequenzierung

 Der Praxisteil umfasst:

  • Real Time PCR mit unterschiedlichen DNA-Präparationen: Probleme erkennen
  • Effizienz- und Inhibitions-Bestimmung
  • Titration der Primer für ein Multiplex
  • Optimierung mittels Magnesium und verschiedenen Annealing-Temperaturen
  • Design of Experiment: Taguchi gegen Kombinatorik

Zielgruppe

Technische und wissenschaftliche Mitarbeiter/-innen, die bereits über PCR-Erfahrungen verfügen.

Dozent

Dr. Johannes Becker-Follmann studierte Biologie und Philosophie in Saarbrücken und Freiburg. Er promovierte am Institut für Humangenetik und Anthropologie in Freiburg über “Vergleichende Genkartierungen bei Mensch und Maus“. Nach Forschungsaufenthalten in Osaka/Japan, Freiburg und Berlin gründete er im Jahr 2000 das Institut für Polymorphismus und Mutationsanalytik in Saarbrücken, das sich hauptsächlich mit der Analyse von DNA verschiedener Spezies beschäftigt. Seit 2002 führt er Seminare und Workshops zu PCR-Themen durch.