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PCR Optimierung

Inhalte & Lernziele

PCR, Real Time PCR und Multiplex-PCR laufen nicht immer zufriedenstellend, sei es dass die Nachweisgrenze zu gering ist, Inhibitoren auftreten, Primer nicht miteinander funktionieren oder einfach Kosten- und Zeitaufwand optimiert werden sollten.
Im Grunde besteht eine PCR-Analyse aus drei Verfahren mit eigenen Qualitätskontrollen: Template-Präparation, das eigentliche PCR und die anschließende PCR-Analytik.
Zum Thema Template-Präparation geben wir einen Überblick über die Vor- und Nachteile verschiedener Verfahren von single cell-Präparationen, quick and dirty, über schwierige Proben, reverse Transcription (cDNA-Synthese) bis zu genomischen DNA-Amplifikations-Kits. Zur PCR-Optimierung werden verschiedene Temperatur-Zeit-Profile und Reagenzien behandelt. In der PCR-Analytik geht es um die Kosten- und Zeitoptimierung, d.h. mit welchem Verfahren bekomme ich am schnellsten und kostengünstigsten ein zuverlässiges Ergebnis.

Im theoretischen Teil werden u.a. folgende Themen behandelt:

  • Prinzip der PCR und Real Time PCR
  • Komplexität unterschiedlicher Templates: Arabidopsis bis Zika-Virus
  • Methoden der Template-Präparation im Überblick
  • Ausgewählte Methoden: single cell DNA-Präparation, Nahrungsmittel, cDNA-Synthesen, genomische Amplifikation 
  • PCR: Temperatur-Zeit-Profile, Annealing-Temperatur, Magnesium und Primer-Titration
  • Multiplex-PCR: Puffer und Additive, Primer- und Sonden-Kontrolle, OD-Messung, in-silico PCR, BLAST, Oligoanalyzer
  • PCR-Analytik: wir diskutieren und vergleichen verschiedene Verfahren zum Nachweis von DNA-Fragmenten, zur Genotypisierung und zur Sequenzierung

 Der Praxisteil umfasst:

  • Real Time PCR mit unterschiedlichen DNA-Präparationen: Probleme erkennen
  • Effizienz- und Inhibitions-Bestimmung
  • Titration der Primer für ein Multiplex
  • Optimierung mittels Magnesium und verschiedenen Annealing-Temperaturen
  • Design of Experiment: Taguchi gegen Kombinatorik

Zielgruppe

Technische und wissenschaftliche Mitarbeiter/-innen, die bereits über PCR-Erfahrungen verfügen.

Dozent

Dr. Johannes Becker-Follmann studierte Biologie und Philosophie in Saarbrücken und Freiburg. Er promovierte am Institut für Humangenetik und Anthropologie in Freiburg über “Vergleichende Genkartierungen bei Mensch und Maus“. Nach Forschungsaufenthalten in Osaka/Japan, Freiburg und Berlin gründete er im Jahr 2000 das Institut für Polymorphismus und Mutationsanalytik in Saarbrücken. Seit 2017 ist er Leiter des Forschungs- und Entwicklungslabors der Eluthia GmbH und entwickelt Tests für die post- und pränatale Diagnostik.  Seit 2002 führt er Seminare und Workshops zu PCR-Themen durch.